Reazione a catena della polimerasi in tempo reale

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July 1, 2022

La reazione a catena della polimerasi in tempo reale (inglese: reazione a catena della polimerasi in tempo reale, PCR in tempo reale, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale, qPCR) è un metodo sperimentale basato sulla reazione a catena della polimerasi in biologia molecolare. La reazione a catena della polimerasi in tempo reale misura simultaneamente la quantità e l'amplificazione di una molecola di DNA bersaglio. Vengono eseguiti il ​​rilevamento e la misurazione della quantità di sequenze specifiche nei campioni di DNA. La pesatura può contare le copie effettive o le proporzioni relative.

Nome

qPCR (quantitative PCR) è anche usato come abbreviazione di reazione a catena della polimerasi in tempo reale. La reazione a catena della polimerasi in tempo reale viene spesso definita qRT-PCR. D'altra parte, ciò che viene comunemente chiamato "RT-PCR" si riferisce a una reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa, non a una PCR in tempo reale. Tuttavia, non tutti gli autori aderiscono a questa convenzione.

Processo sperimentale

La procedura sperimentale segue una reazione a catena della polimerasi generale. Una caratteristica importante è che il DNA amplificato viene misurato in tempo reale. Questa è la differenza dalla reazione a catena della polimerasi di base in cui si osserva il DNA alla fine. Due metodi generali vengono utilizzati nella reazione a catena della polimerasi in tempo reale. Una macchia fluorescente non specificata in grado di intercalare qualsiasi doppia elica del DNA. Viene rilevato dopo il legame a un bersaglio di DNA complementare. Una sonda DNA sequenza-specifica costituita da oligonucleotidi. Sonde etichettate in modo fluorescente, che vengono rilevate anche dopo il legame a un target di DNA complementare.Spesso, il concatenamento della polimerasi in tempo reale viene eseguito insieme alla polimerasi di trascrizione inversa per quantificare l'mRNA cellulare o tissutale e l'RNA non codificante.

Ciclo

La PCR in tempo reale viene eseguita in un ciclo termico con la capacità di illuminare ciascun campione con luce di almeno una lunghezza d'onda specificata e rilevare la fluorescenza emessa dal fluoroforo eccitato. I termociclatori possono anche riscaldare e raffreddare rapidamente i campioni, sfruttando le proprietà fisico-chimiche dell'acido nucleico e delle DNA polimerasi. Il processo PCR di solito consiste in una serie di variazioni di temperatura ripetute da 25 a 50 volte. Questi cicli sono generalmente costituiti da tre fasi. Separare i doppi filamenti degli acidi nucleici a circa 95 gradi centigradi. Consentire ai primer di legarsi al modello di DNA a una temperatura di circa 50–60 gradi centigradi. A 68–72 °C accelera la polimerizzazione effettuata dalla DNA polimerasi. A causa delle piccole dimensioni dei frammenti, l'ultimo passaggio viene solitamente omesso in questo tipo di PCR poiché l'enzima può replicare gli ampliconi del DNA durante la transizione tra le fasi di allineamento e denaturazione. Il colorante fluorescente specifico utilizzato nella PCR viene misurato in brevi passaggi di temperatura della durata di pochi secondi in ciascun ciclo con una temperatura di circa 80 ° C. La temperatura e i tempi utilizzati per ciascun ciclo dipendono dall'enzima utilizzato per la sintesi del DNA, lo ione bivalente nella reazione e la concentrazione di desossiribonucleotide trifosfato (dNTP) e la temperatura di legame dei primer.

Usa

Esistono numerose applicazioni per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in laboratorio. È comunemente usato sia nella ricerca diagnostica che di base. Gli usi di questa tecnologia nell'industria includono la quantificazione della carica microbica di alimenti o vegetali, il rilevamento di organismi geneticamente modificati (OGM), la quantificazione e la genotipizzazione dei patogeni virali umani.

Misurazione del livello di espressione genica

La quantificazione dell'espressione genica con i tradizionali metodi di rilevamento del DNA non è affidabile. Il rilevamento di mRNA in Northern blot o prodotti PCR in gel o Southern blot non consente una quantificazione accurata. Ad esempio, la quantità di prodotto del DNA durante 20-40 cicli di una tipica PCR